1. Mikrobiologie

Izolace mikroorganismů z potravinářských a ostatních matric je prováděna podle platných mikrobiologických norem (ČSN, IDF, ISO) na selektivních živných médiích s případným použitím antibiotických suplementů. Sbírka disponuje potřebným certifikovaným vybavením pro mikrobiologickou práci (izolační boxy typu biohazard, možnost aerobní a anaerobní kultivace, termostaty, odstředivky lyofilizátor, mrazáky, chladící boxy, mikroskopy) s pravidelnou kontrolou metrologických dat. Sbírka uchovává bakterie formou lyofilizace a hlubokého mražení (-70°C), formou živých kultur na šikmých agarech s pravidelnou obnovou dle směrnic SOP. Kvasinky jsou uchovávány jako živé kultury na šikmých agarech, a mražené kultury pod glycerínem. Potravinářské plísně jsou uchovávány jako živé kultury na šikmých agarech s pravidelnou obnovou dle SOP.

2. Molekulární a proteomické metody

Metody identifikace a re-identifikace kmenů bakterií ve sbírce CCDM Laktoflora je založen na klasických mikrobiologických metodách a na genetických metodách založených na sekvenaci úseků 16S rRNA obecně a specifických pro rody Lactobacillus, Lactococcus sp, Streptococcus sp, Enterococcus sp., Propionibacterium sp. aj. Amplifikace úseků se provádí metodami PCR (Multiplex, Nested aj.) s následným klonováním či přímým sekvenováním amplifikovaného úseku. Kvasinky se identifikují pomocí klasických popisných mikrobiologických metod (Kurtzman et al, 2011). Taxonomicky jsou identifikovány na základě sekvenace tří genových úseků, zahrnující ITS 5.8S r DNA, SSU a LSU rDNA (D1/D2 doména) (Kurtzman et al, 2011, Schoch et al, 2012), případně se druhová příslušnost upřesňuje intraspecifickými markery mimojaderné DNA. Potravinářsky využitelné plísně, především rod Penicillium sp., jsou identifikovány na základě jaderných a nejaderných úseků DNA - zahrnující ITS 5.8S r DNA, LSU rDNA a markery mitochondriální DNA podle (Frisvad et al, 2015). Pomocí molekulárních metod jsou rovněž detekovány geny zodpovědné za funkční a probiotické vlastnosti izolátů a kmenů, jako je produce exopolysacharidů a bakteriocinů. Produkce bakteriocinů in vitro je následně ověřována proteomickými metodami jako je SDS - PAGE a Tricine - SDS PAGE. Sbírka je vybavena za tímto účelem vybavena: flowboxy, cyclery Biometra, DGGE (CBS SCIENTIFIC), RT-PCR STEP ONE PLUS, AB elektroforetickými komplexy Biometra a Biorad, mrazáky chladnicemi, autoklávy, termostaty apod.

3. Probiotické a funkční vlastnosti

Identifikace probiotických vlastností zahrnuje molekulární analýzy – detekce genů zodpovědných za některou z těchto vlastností a následně testy in vitro, během nichž se sleduje fenotypový projev těchto genů a podmínky. Jako příklad lze uvést například detekce bsh genů (hydrolázová aktivita) u Lactobacillus plantarum a následně kontrola tolerance přítomnost hydrolázových solí v médiu in vitro. U kmenů, kde byly detekovány bakteriociny se prování antimikrobiální testy na agarových plotnách vůči kontaminantům. Dále jsme schopni fluorometricky hodnotit schopnost asimilovat cholesterol, přeživnost v gastrointestinálních médiích, fytázovou aktivitu, produkci vybraných biogenních aminů.

Funkční vlastnosti, jako fermentace substrátů, interakce se starterovými kulturami, produkce exopolysacharidů v potravinářských matricích a pod. jsou hodnoceny při experimentech v laboratorních podmínkách a podle možností i v poloprovozních výrobách.